Yağ Dokusu Kök Hücre, ADSC Elde Edilmesi

Yağ dokusunda bulunan yağ hücreleri-adipositler doku volümünün % 90 nını oluşturmakta. Dokuda bulunan toplam hücrelerin % 65 ni adipositler oluşturmakta. Adipositler dışında kalan hücresel gurup; yağ öncül hücreleri-preadipocytes, fibroblastlar, damar düz kas hücreleri, endotel hücreler, monosit/makrofaj ve lenfositler gibi kan hücreleri, perisitler gibi, destek /damarsal doku bölümü-Stromal Vascular Fraction (SVF) olarak tanımlanmakta. Yağ dokusu erişkin mezenşimal kök hücreler olan ADSC hücreleri bu gurupta yer almakta.

1 gr yağ dokusunda yaklaşık olarak 5000 üzerinde mezenşimal kök hücre-ADSC varlığı farklı linik çalışmalarda gösterilmiştir( Bouquest ve arkadaşları 2006 yılı çalışmalarında 300 ml aspirasyon ile alınan yağ dokusunda 10.000 ADSC sayısından, Francis ve arkadaşları 2010 yılındaki çalışmalarında 250 ml aspirasyon ile alınan yağ dokusunda 250.000 ADSC saysından bahsetmekte).

1 gr yağ dokusunda iki milyon stromal vasküler hücre bulunmakta. ADSC bunun sadece % 5-10 nunu oluşturmakta.

Yağ dokusundan ADSC elde edilmesi son derece önemlidir. Burada birinci öncelik elde edilen 1 gr lık lipo asipirasyon hücre süspansiyonunda % 80 üzerinde canlı hücrelerin olduğu yarım milyon ile bir milyon arasında hücrenin elde edimesidir. Bu standartın elde edilmesini etkileyen bazı faktörler bulunmaktadır.

Deri Altı Yağ Dokusunun Alınma Yöntemi

ADSC yağ dokusundan elde edilmesinde ilk basamak yağ dokusunun alınması.

Yağ dokusu cerrahi olarak alınabilir yada liposakşın yönteminde olduğu gibi aspire edilerek hücre süspansiyonu şeklinde toplanabilir. Her iki yöntem etik olarak onaylanmış, hasta için güvenililebilir ve sağlıklı ADSC elde edilen yöntemleridir. Yakın zamanda yapılan bir çalışmada liposakşın ile elde edilen ADSC hücrelerin kapasitesi, homojeniteleri daha yüksek bulunmuştur.

Cerrahi yada liposakşın yöntemi ile elde edilen hücre süspansiyonunun % 65 yağ hücreleri % 30-35 i yağ dokusu destek-damarsal hücreleri yani SVF dir.

Liposakşın-Lipoaspirasyonun Uygulanma Şekli

Lipoaspirasyon karın alt kısmında lokal ve/veya tümesent(şişirme) anestezisi ile alınmakta. Lokal ve tümesent anestezi sırasında lokal anestezik olarak lidokain, adrenalin ve serum fizyolojik kulllanılmakta. Bunların yağ dokusu hücreleri olan adipositler ve SVF hücreleri üzerinde etkileri araştırılmıştır. Yapılan çalışmalarda bunların sadece adipositler üzerinde etkileri gösterilmiştir. Bu nedenle SVF ve ADSC elde edilecek ise tümesent anestezisiz yada az tümesent anestezi ile lipoaspirasyon yapılmakta.

Yağ dokusunun lipoaspirasyonunda sıklıkla kullanılan yöntemler ve ADSC üzerine etkileri;

Lazer ile liposakşın- laser-assisted liposuction-LAL; lipoaspirasyon sırasında SVF ve ADSC üzerine negarif etkileri nedeni ile tercih edilmez.

Ultrasound ile liposakşın- Ultrasonic-Assisted Liposuction- UAL;lipoaspirasyon sırasında SVF ve ADSC üzerine negarif etkileri nedeni ile tercih edilmez.

Basınç Su ile liposakşın- water-jet assisted liposuction- WAL; lipoaspirasyon için uygun olarak tanımlanmakla birlikte Coleman yöntemine göre ADSC elde edilme oranları biraz düşüktür.

Coleman tekniği ile lipoaspirasyon;2.5 mm iç çapı olan özel Coleman kanülleri, 10 ml enjektör ve 275 mm Hg negetif basınç(boş 10 ml enjektör pistonu her defasında 1-3 ml geriye çekilerek bu negatif basınç yaratılmakta) ile lipoaspirasyon günümüzde halen en etkili yöntem olarak görünmekte.

Coleman tekniği miktar ve nitelik açısından yüksek oranlarda SVF ve bundan ADSC elde edilmesi için en etkili metod olarak görünmekte. Özellikle lokal anestezi ile(tümesent anestezi kullanılmadan yada az kullanılarak) ml lipoaspirasyonda 1,019,129 hücre edilebilen çalışmalar bulunmakta.

Lipoaspirasyon Hücre Süspansiyonundan SVF ve ADSC Elde Edilme Yöntemleri

Coleman yöntemi ile elde edilen lipoaspirasyon materyali içerisinde yağ dokusu hücre süspansiyonu, yağ hücrelerin parçalanması ile açığa çıkan yağ, kan hücreleri, parçalanmış doku artıkları ve lokal anestezik madde bulunmakta.

Bu süspansiyon özel standlarda 3 dakika bekletilir ve sonra santrifüje alnınır. Bu süreçlerde süspansiyonda doku hücre gurupları dansitelerine göre kendişiğinden hızla ayrılmakta.

Sadece yağ dokusu süspansiyonu kalacak şekilde diğer dokular uzaklaştırılır.

Yağ dokusu süspansiyonu içerisine steril serum fizyolojik yada Ringer Laktat solüsyonları konularak hücre süspansiyonu 2-3 kez yıkanır.

Yağ dokusu süspansiyonundan SVF elde edilmesi için 2 temel yöntem kullanılmakta.

Enzimatik Yöntem

Yağ dokusu süspansiyonu tamponlanmış fosfat solüsyonu ile yıkanır. Bu uygulama süspansiyon içerisinde kalmış olabilecek kan hücreleri, lokal enestezi içerisindeki lidokain ve sodyum klorürü süspansiyondan ayırmaktadır. Daha sonra 0.075% kolajenaz tip I enzimi eklenmekte. Sonrasında aynı miktarlarda % 10 luk fetal sığır serum içerisinde "Dulbecco’s modified Eagle’s medium" eklenerek enzim inaktive edilmekte. Bu süspansiyon 1 saat 37 C derecede inkübasyonda bekletilmekte. Böylece süspansiyon içererisinde hücreler sindirilmekte ve kolejenaz inaktive edilmekte.

Sonrasında santrifüj uygulandığında SVF elde edilmekte.

Klinik ve laboratuvar çalışmalarında enzimatik yöntemde daha fazla ADSC elde edildiği gözlenmiştir. Bu yöntemde 100 ml yağ dokusu süspansiyonundan 9.06 x 105 ADSC elde edilmekte(totalin % 25.9 u). Bu yöntemle daha fazla ADSC elde edilmekle birlikte mekanik yöntemde SVF elde edilme süresi ortalama 15-20 dakika iken burada 80-120 dakika kadar daha uzundur. Ayrıca kolejenaz enzimi içeren SVF tekrar dokulara uygulanacağı için deride ülser, sinir, tendon ve ligament hasarı gibi yan etkileri hatta allerjik reaksiyon riskleri bulunmaktadır.

Mekanik Yöntem

Enzimatik yöntemin uzun sürmesi, ekonomik olarak pahallı olması, uzun sürmesi ve içeriğinde kalan kolejanazın yan etki riskleri nedeni ile SVF elde edilmesinde makanik yöntemler kullanılmakta. Burada herhangi bir enzim kullanılmadan yağ dokusu süspansiyonundan tamamen kapalı ve steril koşullarda steril serum fizyolojik yada Ringer laktat ile yıkama, filtrelerden geçirme, vibrasyon ve santrifüj yöntemlerini kullanrak SVF hücreleri adiposit hücrelerden ayrılmakta.

Bu yöntemle 1 cc yağ dokusu süspansiyonunda 10.000-240.000 SVF hücresi elde edilmekte. SVF tüm dokularda bulunan destek doku ve damarsal yapıları tanımlamakta( SVF; Stromal Vascular fraction ). Bu nedenle SVF içeriklerinde fibroblastlar, hematopetik kan hücreleri, endotel hücreler, perisitler, peri adipositler ve ADSC bulunmakta. Elde dilen SVF içerisinde ADSC oranı % 5-10 arasındadadır.

Bu nedenle SVF nin kök hücre gibi tanımlanması son derece yanlış ve etik olmayan bir tanımlamadır(daha detaylı bilgi için...).

100 ml yağ dokusu süspansiyonundan bu yöntemle 6.25 x 105 ASDC hücre elde edilmekte(totalin % 5 i).

Kültüre Edilmiş ADSC

ADSC erişkin mezenşimal kök hücrelerdir ve bunlar uygun koşullarda kültüre edilerek çoğaltılabilirler. Bu kültür süresi 2-4 gün sürmektedir.

Elde edilen ADCS vücuda tekrar tedavi amaçlı kullanılmakta. ADSC kültür ortamında stabil hücre guruplarıdır. 100 den fazla aynı hücre kültüre edilebilmekte.

Kültür sırasında ADSC hücrelerin çoğalması için ortamda uyaran büyüme faktörleri kulllanılmakta. Fibroblast büyüme faktörü 2-FGF-2, Epitel büyüme faktörü-EGF, İnsüline benzer büyüme faktörü 1-IGF-1, Platelet kaynaklı büyüme faktörü-PDGF, Tümör nekroze faktör alfa-TNF-alfa gibi.

Kültüre ADSC hücrelerine bakıldığında diğer mezenşimal kök hücrelere benzer şekilde yüzey işaretleyiciler salgıladıkları görülmekte. Bunlardan başlıcaları; CD13, CD29, CD34 (kök hücre markerları), CD44, CD73, CD90, CD105 (mezenşimal kök hücre markerları) dır.

ADSC hücrelere CD166, MHC I, CD14, CD31, CD45 ve CD133 gibi kan hücreleri markarlerı çok düşük ölçülmüştür.

Mezenşimal kök hücreleri olan ADSC günümüzde bir çok hastalığın tedavisinde kullanılmakta ve araştırmalar devam etmekte.

- ATip diyabetes mellitus-DM type I
- Kalp dokusunun onarımı(kalp krizi-enfaktüs sonrası hasarlanmış kalp dokusunun onarımı)
- Nörolojik hastalıklar
- Otoimmun hastalıklar
- İnflamatuar ve dejeneratif hastalıklar gibi.

Bu hastalıklarda kullanılma prensibi erişkin mezenşimal hücrelerin farklı dokularar uygulandığında bu doku hücrelerine dönüşebilme prensibine dayalıdır. Ancak bu konuda klinik deneysel çalışmalra halen decav etmekte.

Yağ dokusu kaynaklı erişkin meznşimal hücreler dokuya uygulandığında aşağıda tanımalanan dokuda süreçleri yaptığını artık biliyoruz.

- İmmün sistem ve inflamasyon üzerinde düzenleyici etkileri
- Genetik programlı hücresel ölümün-apopitozisin baskılanması
- Dokuda var olan mezenşial kök hücrelerin aktivasyonu
- Anjiyogenezis yani dokuda yeni damarsal yapıların oluşumu
- Dokda yeni snirsel netork oluşumu
- Sinir dokunun korunması
- Antioksidan